Церковь сооружалась в 1734-1747 годах по проекту Ивана Бланка при участии Михаила Земцова. Незадолго до освящения храма в Царское Село трехдневным крестным ходом была перенесена чудотворная икона Пресвятой Богородицы "Знамение". В храме молились лицеисты, в том числе Александр Пушкин. В 1899 году храм был капитально отремонтирован по проекту Сильвио Данини.
К началу Великой Отечественной войны он остался единственным действующим в Пушкине. При немецкой оккупации города верующим было разрешено вывезти Знаменскую икону. Она оказалась в Латвии и после войны была доставлена в Ленинград.
Митрополит Григорий (Чуков) передал ее в
храм ЛДА, где она находится поныне.
После войны храм использовался как книжный склад, затем как реставрационные мастерские Екатерининского дворца. В 1991 году его передали епархии в плачевном состоянии. 10 декабря 1991 года в нем была отслужена первая Божественная литургия, реставрация продолжалась пятнадцать лет.